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硕士研究生:张景景2018年江苏省优秀硕士学术学位论文)

导师:徐美娟教授

专业:微生物学

论文题目:钝齿棒杆菌N-乙酰谷氨酸激酶分子改造及其在L-精氨酸合成中的应用

摘要:N-乙酰谷氨酸激酶是钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatumSYPA5-5合成L-精氨酸途径中的关键限速酶受到终产物L-精氨酸的反馈抑制。本研究以来源于钝齿棒杆菌SYPA5-5N-乙酰谷氨酸激酶CcNAGK为研究对象通过饱和突变和定点突变对其进行分子改造解析反馈抑制机理并进行催化性能的研究在此基础上获得既能解除产物反馈抑制又提高酶的催化活性和热稳定性的优良突变体应用突变体提高了L-精氨酸的产量。主要研究内容如下:(1基于CcNAGK三维结构并结合分子对接分析首先对其L-精氨酸结合域的关键位点E19进行饱和突变根据半抑制常数的变化规律和精氨酸结合位点结构的变化来解析反馈抑制解除机理。结果表明CcNAGK精氨酸结合域入口处E19位点决定了L-精氨酸能否进入Arginine-ring19位点所带负电荷对于精氨酸的结合至关重要反馈抑制解除的效果与19位残基负电荷和侧链大小及形状有关其中突变体E19FE19WE19YI0.5R值比野生酶CcNAGKI0.5R=0.39 mmol提高了约380解除了L-精氨酸对其的反馈抑制作用。为了验证最佳突变体E19Y在胞内对于解除精氨酸的抑制是否有效将突变基因argBE19YC.crenatumSYPA5-5中过量表达并将重组菌SYPA-E19Y进行5 L上罐发酵96 hL-精氨酸的产量为55.3 g·L-1比原始菌提高27.9%2CcNAGK活性中心关键位点G71I74F91进行饱和突变根据其底物结合位点结构分析与动力学参数的测定进行催化性能的研究。发现CcNAGK的催化活性与稳定性不仅与底物结合位点残基的大小、形状极性与非极性氢键的形成以及是否带电荷有关还与芳香族性质疏水作用以及活性中心的构象有关。从饱和突变文库中获得了三个催化效率与热稳定性显著提高的突变体I74VF91YF91H,其比酶活分别提高38%41%52%并且在30℃下的半衰期由野生型的37 h分别延伸至73 h86 h102 h。(3为进一步提高CcNAGK的性能将处于α-螺旋与β-折叠的转角处位点K234根据同源多序列比对对该点定点突变获得了显著提高热稳定性的突变体K234NK234T其中突变体K234T30℃下的半衰期可延长至108 h4将位点E19Y和位点I74VF91HK234T进行组合突变获得既能解除产物反馈抑制又显著提高其催化活性及热稳定性的优良突变体NAGKEH3其半抑制常数提高382催化活性提高1.7330℃下的半衰期延长至118 h。为了考察在解除L-精氨酸反馈抑制的基础上提高CcNAGK的催化活性和热稳定性对精氨酸合成的影响将组合突变基因argBEH3通过表达质粒pDXW-10C.crenatumSYPA5-5中过量表达构建重组菌株C.crenatumSYPA-EH3并在5 L发酵罐中培养96 h最终使得L-精氨酸产量可达61.2 g·L-1比原始菌提高41.8%

关键词:钝齿棒杆菌;N-乙酰谷氨酸激酶;理性突变;酶学性质;L-精氨酸




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