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硕士研究生:杨彬2019年江苏省优秀硕士学术学位论文)

导师:刘立明教授

专业:发酵工程

论文题目:构象动力学方法改造酶性能以生产医药中间体

摘要:生物催化凭借其环保、高效等优点,广泛应用于生产医药中间体。在这一过程中,生物催化剂(酶)性能是生物催化过程的关键,其活性、选择性、稳定性和底物耐受性的高低将直接影响到催化效率,关系到将来能否实现大规模产业化应用。因此,广泛应用蛋白质工程改造策略改善酶的特性。构象动力学工程,就是基于对酶的构象动力学分析所开发的新技术手段,已成为蛋白质进化的有效策略,在降低产物抑制和酶的理性设计等方面取得了显著效果。本论文建立了构象动力学工程方法,并介绍了其在提高南极假丝酵母脂肪酶B (CALB, EC 3.1.1.3)对映体选择性生产(R)-3-叔丁基二甲硅氧基(TBDMSO)戊二酸单甲酯和降低L-氨基酸脱氨酶(L-AAD, EC 1.4.3.2)产物抑制生产苯丙酮酸(PPA)工艺中的应用。主要研究如下:1.构象动力学工程方法的建立。通过分析酶的构象在酶催化过程中发挥重要作用,引出基于构象动力学的酶分子改造策略;建立了构象动力学工程方法进行酶改造的流程:获取酶的三维结构、分子对接、选择拟突变氨基酸位点、分子动力学模拟设计最佳突变体、突变体的评价;根据实验需求,选择了同源建模软件Swiss-model、分子对接软件Autodock Vina、分子动力学模拟软件GROMACS 4.5.5等,并将其移植到超级计算机“神威·太湖之光”计算系统,完成了构象动力学工程方法模拟平台的搭建。2.构象动力学工程方法提高CALB的对映体选择性。通过结构分析和分子动力学模拟,对CALB结合口袋周围loop结构上的候选氨基酸进行模拟丙氨酸扫描筛选,确定了关键位点A281D223;在该位点进行模拟饱和突变,根据酶的结合口袋构象动力学变化(RMSF),设计得到最佳突变体M0(A281S/D223V)M0的活性口袋和通道处的结构束缚增强,催化关键氨基酸与R-产物的距离减小,与S-产物的距离变大,与两种产物的结合能之差从3.86 kJ·mol-1增加到17.49 kJ·mol-1S-产物的初始合成速率(VS)急剧下降,R-产物的初始合成速率(VR)略有降低,VR/VS值从1.17提高至200.1130下的对映体选择性从8.00%提高至99.00%,突变酶的动力学参数变化与对映体选择性变化一致。突变体M0经过条件优化,在初始葡萄糖浓度为25 g·L-1的培养基中培养,利用葡萄糖为诱导剂,在28诱导48 h酶活力最高达15000 U·mL-1;酶液与载体以25:1 (v:w)的比例,在37条件下固定化5 h,用pH8的缓冲液清洗后冻干,固定化酶活力最高为2500 U·g-1;将80 g·L-1的固定化酶和60 g·L-1底物在30下转化12 h(R)-3-TBDMSO戊二酸单甲酯R-ee值为99.00%,时空产率为107.54 g·L-1·d-13.构象动力学工程方法降低PPAL-AAD的产物抑制。通过对酶结构分析,确定产物PPA周围loop结构上的候选氨基酸位点;根据构象动力学工程原理,在候选氨基酸位点处引入突变,构建单突变体,完成丙氨酸扫描,获得PPA产量提高的单突变体T105AE145AS412AE340AE417A,其中,T105A产量最高达47.18 g·L-1;将上述单突变体进行组合,筛选获得PPA产量进一步提高的五点组合突变体M5(T105A/E145A/S412A/E340A/E417A)PPA产量达到69.50 g·L-1,比野生型产量提高约70%;突变体M5的产物抑制常数KPI22.80±0.9 g·L-1增大到84.40±2.2 g·L-1,动力学参数kcat值比野生型增加了2倍,催化效率(kcat/KM)是野生型的1.6倍。运用计算机模拟分析突变体M5的构象动力学变化,发现突变引起通道处两个Flap结构的RMSF值变大。经过条件优化,突变体M5TB培养基中培养至OD 0.8,添加乳糖(5 g·L-1)25下诱导12 h,酶活力最高为50 U·g-130 g·L-1的湿菌体和75 g·L-11 L-苯丙氨酸在30pH 7.5的条件下转化12 hPPA的产量最高为72.50 g·L-1,转化率96.67%

关键词:构象动力学工程南极假丝酵母脂肪酶BL-氨基酸脱氨酶对映体选择性产物抑制(R)-3-TBDMSO戊二酸单甲酯苯丙酮酸




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